Hijo de Macedonio Fernández, estanciero y militar, y de Rosa del Mazo Aguilar Ramos. En 1887 cursa sus estudios en el Colegio Nacional Central.
Durante 1891-1892 publica en diversos periódicos una serie de páginas costumbristas incluidas más tarde en Papeles antiguos, primer volumen de sus Obras completas (Buenos Aires: Corregidor). Compañero y amigo del padre del escritor Jorge Luis Borges , con Jorge Guillermo Borges (padre del escritor), comparten el interés por el estudio de la psicología de Herbert Spencer y por la filosofía de Arthur Schopenhauer.
En 1897 la Facultad de Derecho de la Universidad de Buenos Aires le otorga el título de doctor en jurisprudencia por una tesis titulada De las personas que todavía permanece inédita.
Publica en La Montaña, diario socialista dirigido por Leopoldo Lugones y José Ingenieros.
En 1898 recibe su diploma de abogado. Al año siguiente se casa con Elena de Obieta, con quien tendrá cuatro hijos.
Publica en 1904 algunos poemas en la revista Martín Fierro (que no hay que confundir con revista vanguardista del mismo nombre publicada durante los años 20 y en la que tendrá un papel muy activo).
En 1907 publica un trabajo sobre psicología titulado "Ensayo de una nueva teoría de la psiquis" en el que opone al enfoque fisiológico y positivista de esta disciplina (sostenido en aquel momento en Argentina por José Ingenieros), un enfoque puramente psicológico o espiritual.
Al menos un testimonio escrito indica que en esa misma época Macedonio Fernández aspiraba a la obtención de un puesto en la enseñanza, probablemente en psicología o en filosofía, tal vez similar al que ejercía su amigo Jorge Guillermo Borges, profesor de psicología en el Instituto de Lenguas Vivas en ese entonces.1 Es en ese artículo que Macedonio Fernández hace público, con evidente orgullo, un intercambio epistolar con su admirado William James.
En 1910 obtiene el cargo de Fiscal en el Juzgado Letrado de la ciudad de Posadas, en la provincia de Misiones, que desempeña durante algunos años.
En 1920 muere su esposa. Los hijos quedan al cuidado de abuelos y tías.
Abandona la profesión de abogado. Cuando Jorge Luis Borges vuelve de Europa en 1921 redescubre a Macedonio, con quien comienza una prolongada amistad. Borges, hacia 1960, dicta -ya ciego- un breve y sustancioso prólogo para una antología de Macedonio. Allí se nos dice que ninguna persona lo impresionó tanto como él. Hombre que no se cansaba de ocultar, antes que mostrar, su inteligencia proverbial. Macedonio prefería el tono de consulta modesta antes que el dictamen pontificador.
Su tono habitual era el del ánimo perplejo. Lo caracterizaba la veneración de Cervantes, una cierta divinidad, para él. Detestaba todo aparato erudito, que entendía como una manera de eludir el pensamiento personal. De esta manera su actividad mental era incesante. Vivía desinteresado de las críticas ajenas, de confirmaciones o refutaciones exteriores. Con desparpajo y no cuestionada generosidad, atribuía su propia inteligencia a todos los hombres. Poseía la veneración supersticiosa de todo lo argentino. Y ejecutaba, en grado eminente, el arte de la soledad, y de la inacción. Sin hacer absolutamente nada, era capaz de permanecer solo, por horas. Pensar -no escribir- era su devota tarea. Aunque también solía, en la soledad de su pieza, o en la turbulencia de un café, abarrotar cuartillas en caligrafía minuciosa. Empero, no le asignaba valor a su palabra escrita. Dos temores lo atravesaban: el del dolor y el de la muerte. Borges conjetura que para eludir este último postuló la metafísica inexistencia del yo.
En lo que concierne a la literatura, le importaba menos que el pensamiento y la publicación le era más indiferente que la literatura. Así, su vocación fundamental era la contemplativa y la persecución del desciframiento del misterio filosófico del universo.
En 1928 se edita No toda es vigilia la de los ojos abiertos, a instancias de Raúl Scalabrini Ortiz y Leopoldo Marechal. Publica al año siguiente Papeles de Recienvenido. Durante este período, se preocupa por crear expectativas respecto a la posible aparición de la novela Museo de la Novela de la Eterna. En 1938 publica "Novela de Eterna" y la Niña del dolor, la "Dulce-persona" de un amor que no fue sabido, anticipación de Museo de la Novela de la Eterna.
Tres años más tarde publica en Chile Una novela que comienza.
En 1944 se publica una nueva edición de Papeles de Recienvenido. En 1947, Macedonio se instala en la casa de su hijo Adolfo, donde residirá hasta su muerte.