Antes de morir, Martínez de Irala encomendó a Nufrio de Chávez poblar en los xarayes y a Ruy Díaz de Melgarejo en el Guayrá. Ambas empresas se cumplieron bajo el gobierno de su sucesor, Gonzalo de Mendoza. La ambición de los conquistadores los llevaba a menudo a una acción independiente. Nufrio de Chávez desoyó las recomendaciones del cabildo de Asunción y se internó tierra adentro con el propósito de formar un gobierno aparte del Río de la Plata; con ese fin fundó Santa Cruz de la Sierra, que sirvió de base para la creación de una nueva provincia.
La fundación del Guayrá a cargo de Ruy Díaz de Melgarejo en 1557, con los restos de la antigua población de Ontiveros, no ofreció ventajas especiales, pues no se pudo establecer una comunicación con la costa de San Francisco a causa de la oposición de los tupíes y de los portugueses; tampoco pudieron beneficiarse las muestras de metal que se suponía precioso.
Gonzalo de Mendoza murió en 1558 y el vecindario de Asunción eligió para sucederle a Francisco Ortiz de Vergara. El nuevo gobernador percibió el aislamiento en que se encontraba Asunción, a donde escasamente llegaban las noticias de España; en dos arios no se había podido comunicar la noticia de la muerte de Martínez de Irala. En vista de esa situación, después de fracasar las tentativas de poblar San Francisco y Sancti Spíritus, la colonia asunceña resolvió en 1562 fundar aguas arriba del Pilcomayo, en las faldas de la cordillera andina, una ciudad que sirviese de nexo entre Asunción y el Perú y la ciudad de La Plata, y que rompiese así en cierto modo el aislamiento del Paraguay.
Fantasías propaladas intencionalmente por Nufrio de Chávez dieron impulso a una especie de éxodo hacia el Perú en 1564, éxodo en que iban Pedro Dorantes y el obispo Fernández de la Torre, oficiales reales y casi todos los clérigos de Asunción con una caravana de españoles, mestizos e indios amigos. Pidieron los expedicionarios ayuda al gobierno peruano para su proyecto de nuevas fundaciones, pero ni la audiencia de Charcas ni el virreinato de Lima escucharon sus peticiones y tuvieron que regresar a Asunción con las manos vacías.
Cuando se fundieron en Potosí unas muestras de mineral aurífero del Guayrá, estaba presente Juan Ortiz de Zárate, acaudalado empresario del Alto Perú, nacido en Orduña, España.
Se avivó entonces en él el interés por el Paraguay y fue propuesto como gobernador del Río de la Plata.
Para confirmar la designación se dirigió a España. Y en las capitulaciones firmadas en 1569 se obligaba a llevar al Paraguay hombres y ganado de sus estancias de Tarija, debiendo también levantar un pueblo a la entrada del Río de la Plata en lo que llaman el puerto de San Gabriel o en el de Buenos Aires, dos entre Asunción y Charcas o La Plata y otros cuatro en los lugares y sitios más convenientes.
La armada de Ortiz de Zárate se componía de gentes muy pobres que acudían a América con el señuelo de fáciles riquezas; salió de España en octubre de 1572 y sufrió desastres en la costa del Brasil y en el Río de la Plata; muchos murieron de hambre o en manos de los indios, pero desde Asunción llegaron pronto auxilios abundantes.
Fundó en el Río de la Plata la ciudad de San Salvador; que no tardó en despoblarse, como lo habían profetizado los que tenían ya alguna experiencia sobre la región. Ortiz de Zárate murió en Asunción el 26 de enero de 1576 y en su testamento nombró por heredera a su hija, Juana, que se hallaba en Charcas y cuya madre había sido una princesa incaica descendiente de Atahualpa, Leonor Yupanqui. Mientras su hija se casase con persona capaz de regir la provincia, la gobernaría su sobrino Rodrigo de Mendieta; Juan de Garay, sobrino también, fue nombrado albacea y ejecutor testamentario.
Melgarejo vivió un tiempo en el puerto luso-brasileño de San Vicente donde nacieron sus hijos y sin poder volver a Europa, se pone a disposición de Irala, y junto a su esposa Elvira, Juan de Salazar y algunos miembros más de la flota de Sanabria, retornó a Asunción en 1555. Irala, que lo veía como amenaza, envió a Melgarejo a colonizar la región de Guayrá ubicada entre el río Paraná y el océano Atlántico. En 1556, luego que Irala falleciese y durante el gobierno de Gonzalo de Mendoza, fundó la Ciudad Real del Guayra, repartiendo las tierras a los asuncenos que lo habían acompañado, realizó un censo y construyó una casa de gobierno en el pueblo.