Como teniente de gobernador de Ortiz de Zárate, Felipe de Cáceres se dispuso a iniciar la fundación de ciudades hacia el sur; Ruy Díaz de Melgarejo fundó en 1570 Villa Rica del Espíritu Santo en las regiones del Guayrá.
Cuando el teniente de gobernador se hallaba en esos planes fundacionales, arremetió contra él, acusándolo de luteranismo, el obispo Fernández de la Torre, que logró acaudillar a españoles y mestizos en número suficiente para derrocar a Cáceres, el cual fue enviado a España cargado de cadenas con el obispo por carcelero durante la travesía.
Una vez derrocado Felipe de Cáceres fue elegido en su puesto Suárez de Toledo, llegado en la armada de Álvar Núñez Cabeza de Vaca en 1540.
El nuevo teniente de gobernador persistió en fundar poblaciones hacia el sur a fin de dar puertas a la tierra para las comunicaciones con el exterior. Además, quizá había también interés en alejar de Asunción a la masa levantisca y creciente de los mestizos, que predominaban por su número y su juventud sobre los españoles peninsulares; comisionó para cumplir esas tareas a Juan de Garay.
Entretanto se casó con la hija de Ortiz de Zárate el licenciado Juan Torres de Vera y Aragón, oidor de la audiencia de Charcas, en diciembre de 1577, con lo cual se convirtió en gobernador del Río de la Plata.
No pudiendo trasladarse a Asunción a causa de los pleitos en que se vio involucrado en virtud de su casamiento, confirmó a Juan de Garay en la misión que le había encomendado Suárez de Toledo y éste siguió siendo teniente de gobernador hasta que llegó a Asunción Juan Torres de Vera y Aragón, lo cual no pudo realizarse hasta 1587.
Juan de Garay preparó la expedición fundadora, que contó con un bergantín, ocho barcos de carga y cierto número de balsas.
Fueron embarcados ganados, plantas, herramientas, etc. Una parte de los futuros pobladores viajó por tierra arreando caballos, yeguas y vacas. De los 89 pobladores de Santa Fe, 80 eran hijos de la tierra, paraguayos; los nueve restantes eran españoles peninsulares.
La expedición partió de Asunción el 14 de abril de 1573, el mismo día en que partía la nave en que iba preso Felipe de Cáceres rumbo a España. En el mes de setiembre, llegó al lugar de la antigua fortaleza de Gaboto, y se halló rodeado de indios en actitud agresiva.
En aquellos momentos descubrió a lo lejos un grupo de desconocidos a caballo que acudían en su ayuda y los indios fueron dispersados. Eran españoles destacados por Jerónimo Luis de Cabrera, que había fundado Córdoba el. 6 de junio de 1573, y habían ido a buscar un puerto sobre el río Paraná para dar una salida a la provincia de la Nueva Andalucía, como fue bautizada la de Córdoba. Discutieron los dos núcleos conquistadores y estuvieron a punto de trabarse en lucha; el día anterior habían estado los hombres de Cabrera en lo que fue el fuerte de Gaboto y lo rebautizaron con el nombre de Puerto de San Luis de Córdoba.
Los grupos se separaron al fin sin haberse puesto de acuerdo, Garay remontó el río para buscar al resto de su expedición y en el lugar que le pareció más indicado, cerca del arroyo Cayastá, fundó la ciudad de Santa Fe el 15 de noviembre de 1573 en nombre de la Real Majestad y del señor Juan Ortiz de Zárate, gobernador de las provincias del Río de la Plata, en virtud de los poderes dados por el teniente de gobernador Martín Suárez de Toledo.
La ciudad, propiamente, existía de hecho desde hacía algunos meses, se distribuyeron tierras y encomiendas y los pobladores comenzaron a trabajar en las tareas iniciales cuando llegó de Córdoba Nufrio Aguilar con unos 30 hombres a reclamar la posesión de la nueva ciudad en virtud de los derechos adquiridos sobre el río Paraná por Jerónimo Luis de Cabrera.
Juan Ortiz de Zárate
En el curso de las discusiones, en febrero de 1574, llegaron unos indios con cartas de Juan Ortiz de Zárate en las que pedía socorro, pues era atacado por indios enemigos.
Garay despachó inmediatamente en su auxilio al indio Yamandú con doce canoas y él mismo salió unos días después con 30 hombres y 20 caballos. A comienzos de mayo de 1574 se incorporó Garay a las gentes de Ortiz de Zárate y Ruy Díaz de Melgarejo y estuvo a punto de perder la vida, pues cayó herido; su caballo fue muerto y quedó rodeado de enemigos.
El impulso colonizador de Asunción no se detuvo en la fundación de Santa Fe, sino que unos años después partió de ella la expedición para la segunda fundación de Buenos Aires y posteriormente hizo surgir las ciudades de Concepción del Bermejo, para afirmar la voluntad de enlazar con el Alto Perú, y la de Vera de las Siete Corrientes, después simplemente Corrientes.
El Paraguay era una tierra de extraordinaria fertilidad y su clima permitía obtener dos cosechas anuales. La ganadería se multiplicaba con facilidad; las frutas eran exuberantes; hubo plantaciones de caña de azúcar y viñedos, y los astilleros de Asunción cobraron pronto importancia, pues muchas de las naves construidas con maderas del país cruzaron con buena fortuna el Atlántico.
Juan Torres de Vera y Aragón