Mientras Martínez de Irala, con los refuerzos llegados de Buenos Aires, se disponía a iniciar la exploración y la conquista de las tierras orientales hasta llegar a la Sierra de la Plata, se presentó en Asunción el nuevo adelantado, Álvar Núñez Cabeza de Vaca, y los planes concebidos fueron postergados. Álvar Núñez había atravesado la selva brasileña desde San Francisco, siguiendo la ruta de Alejo García; con él llegó un núcleo de jóvenes animosos y emprendedores: Felipe de Cáceres, Nufrio de Chávez, Alonso Riquelme de Guzmán, Ruy Díaz Melgarejo, Martín Suárez de Toledo, García Rodríguez de Vergara, Francisco Ortiz de Vergara, Pedro Dorantes, Jaime Rasquín y muchos otros.
El nuevo adelantado Álvar Núñez Cabeza de Vaca se dejó seducir por las leyendas de la Sierra de la Plata, aunque dejaron de ser leyendas cuando se dio con el cerro Potosi; pero comprendió que no se podía dejar a retaguardia las tribus bárbaras al oeste del Paraguay y al sur del Pilcomayo y emprendió operaciones de castigo y sojuzgamiento contra los guaicurúes con el auxilio de los indios aliados.
La operación fue victoriosa en toda la línea y, a consecuencia de la derrota sufrida, los aborígenes de toda la zona se sometieron a mediados de 1542 a los españoles. Pero en ocasión de esa misma campaña se puso de manifiesto la desinteligencia, la escisión entre Álvar Núñez y los partidarios de Martínez de Irala; el comportamiento del primero con sus hombres era aristocrático, altivo, autoritario y chocaba con el de Martínez de Irala, democrático con los suyos, que trataba de no hacer notar ni gravitar su rango ante los demás conquistadores, capitanes o soldados. Además, Álvar Núñez quiso apartar a los españoles del pecado de la poligamia, que fue base de la prosperidad de Asunción.
Alvar Nuñez Cabeza de Vaca
La crisis que se fue gestando hizo explosión en abril de 1544 y Alvar Núñez fue apresado por un amotinamiento popular dirigido por los oficiales reales; al año siguiente se le envió a España acusado de haberse querido convertir en rey de la tierra de su gobernación. La lucha se avivó más por causa de sus antecedentes: Álvar Núñez había combatido al lado de las tropas de Carlos V contra los comuneros de Castilla y muchos de los hombres de Martínez de Irala pertenecían a los vencidos en Villalar.
Álvar Núñez fue apresado al grito de "¡Libertad! ¡Libertad!". La nave que lo condujo a España había sido construida en Asunción y llevaba el nombre de "Comuneros". Ell veedor Cabrera fue el carcelero del adelantado durante el viaje y a su llegada a España enloqueció definitivamente. Por el voto unánime de los amotinados volvió a hacerse cargo de la gobernación Domingo Martínez de Irala.