El 4 de octubre de 1536 Juan de Ayolas partió de Buena Esperanza, pequeño fuerte que habían construido avanzado el río Paraná, para profundizar más en búsqueda de la Sierra de la Plata. La expedición estaba compuesta por una carabela y dos bergantines y se embarcaron 170 hombres, entre ellos el factor Carlos de Guevara, Juan Ponce de León, Francisco Douvrin y Domingo Martínez de Irala.
En el transcurso de esta expedición por el río Paraná surgieron multitud de problemas, como las tempestades que sufrieron que casi dan al traste con la misma; las bajas temperaturas, la multitud de ciénagas, la falta de alimento que fue subsanada gracias a la ayuda de los nativos, etc. A pesar de todo la expedición continuó adelante y navegó el río Paraguay, fundando el 2 de febrero de 1537 el fuerte de la Candelaria. Allí descansaron unos días y dejaron un retén de 30 hombres al mando de Martínez de Irala con la orden de construir una pequeña fortaleza. Ayolas partiría con el resto de hombres el 12 de febrero en dirección a la región del Chaco. Ordenó a Irala que si en 4 meses no habían regresado partiera sin ellos. Nunca volverían a verse.
Juan de Ayolas se encontró el 2 de febrero de 1537 en un punto de su ruta hacia el norte, en el río Paraguay, que llamó La Candelaría; dejó allí como teniente de gobernador a Domingo Martínez de Irala mientras durase su ausencia y emprendió el viaje a través del Chaco hacia el imperio soñado, con 130 hombres.
La travesía fue difícil, pero llegó a los contrafuertes andinos, donde se halló con los indios chané, que le proporcionaron objetos de oro y plata que les llegaban de los indios del Alto Perú.
Con aquellas muestras que hacían más palpable la realidad de la leyenda formada, regresó al Paraguay. En el trayecto dejó en un lugar adecuado a un grupo de españoles para que sirviese de punto de referencia a su vuelta con nuevos elementos. No halló a Martínez de Irala en La Candelaria, y los indios payaguaes, irritados por el trato que habían recibido de los españoles, organizaron un asalto contra los expedicionarios y los mataron a todos. Pormenores del hecho vinieron a saberse más tarde por testimonios de los indios.
Así, de la expedición del adelantado Pedro de Mendoza resultó un saldo trágico: la muerte de sus parientes, del adelantado mismo y de su heredero político.
Juan de Ayolas